Calculadora de Ligação

Categoria: Biologia

- April 04, 2025

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DNA Vetorial

Comprimento do Vetor (bp):

Concentração do Vetor (ng/μL):

Volume do Vetor na Reação (μL):

DNA do Inserto

Comprimento do Inserto (bp):

Concentração do Inserto (ng/μL):

Proporção Molar Vetor:Inserto:

Volume Total da Reação (μL):

Configuração da Reação de Ligação

Quantidade Recomendada de Inserto

50.0 ng

2.00 μL de estoque de inserção

Quantidade de Vetor

50.0 ng

Usando 1.0 μL de estoque de vetor

Proporção Inserto:Vetor

1:3 (molar)

Ótimo para clonagem padrão

Configuração Completa da Reação

Componente	Volume (μL)	Quantidade Final
DNA Vetorial (50 ng/μL)	1.0	50.0 ng
DNA do Inserto (25 ng/μL)	2.00	50.0 ng
T4 DNA Ligase	2.0	400 U
Ligase de DNA T4	1.0	400 U
Água Livre de Nucleases	14.00	Até 20 μL
Volume Total	20.0

Dicas de Otimização

Com base nos seus parâmetros de entrada, aqui estão algumas recomendações:

A proporção de vetor:inserção de 1:3 a 1:5 é ideal para aplicações de clonagem padrão.
16°C é a temperatura padrão para T4 DNA ligase, proporcionando um bom equilíbrio entre atividade da enzima e estabilidade do duplex.
Seu tempo de ligação selecionado (4 horas) deve ser adequado para a maioria das aplicações de clonagem padrão.
Para extremidades adesivas de 5' com sua proporção vetor:inserção, incubar a 16°C por 4 horas deve ser eficaz.
O tratamento do vetor com CIP ajudará a reduzir o fundo de auto-ligação.
CIP é muito eficaz, mas às vezes difícil de inativar completamente por calor. Considere a extração com fenol se estiver enfrentando problemas.
A T4 DNA Ligase padrão funciona bem para a maioria das aplicações com o tempo de incubação apropriado.
Inative a ligase por calor a 65°C por 10 minutos antes da transformação para melhores resultados.

Sobre a Ligação de DNA

A ligação de DNA envolve a união de fragmentos de DNA através da formação de ligações fosfodiéster.
A ligase de DNA T4 requer ATP e Mg²⁺ para funcionar corretamente (fornecido no buffer de ligação).
As ligações de extremidades pegajosas são mais eficientes do que as ligações de extremidades retas.
As proporções molares vetor:inserto geralmente variam de 1:3 a 1:5 para clonagem padrão.
Proporções maiores de inserto:vetor (3:1 a 10:1) são recomendadas para ligações de extremidades retas ou inserções maiores.
A desfosforilação de vetores (usando CIP, SAP, etc.) previne a auto-ligação do vetor.
Sistemas de ligase rápida podem reduzir o tempo de ligação para 5-15 minutos à temperatura ambiente.

Fórmula para Inserir Quantidade (ng):

$Inserir ng = (\frac{Vector ng \times Tamanho do inserto em kb}{Tamanho do vetor em kb}) \times (\frac{Moles do inserto}{Moles do vetor})$

O que é o Calculador de Ligação?

O Calculador de Ligação é uma ferramenta que ajuda pesquisadores a determinar a quantidade apropriada de vetor e DNA de inserto necessária para uma reação de ligação bem-sucedida. A ligação de DNA é um passo crítico na clonagem molecular, onde um inserto de DNA é unido a um vetor plasmidial usando uma enzima chamada ligase de DNA.

Como Funciona?

Este calculador permite que os usuários insiram detalhes sobre seu vetor e inserto, incluindo comprimento e concentração. Com base na razão molar escolhida, ele calcula a quantidade necessária de DNA de inserto para alcançar uma reação de ligação ideal.

Principais Recursos

Calcula razões molares de vetor para inserto para diferentes cenários de clonagem.
Suporta razões molares padrão e personalizadas.
Fornece recomendações para condições de ligação com base em clonagem de extremidades adesivas ou cegas.
Inclui dicas de otimização para melhorar a eficiência da ligação.

Como Usar o Calculador

Insira o comprimento do vetor (bp) e a concentração (ng/μL).
Insira o comprimento do inserto (bp) e a concentração (ng/μL).
Selecione a razão molar desejada de vetor para inserto (por exemplo, 1:3, 1:5).
Especifique o volume total da reação (por exemplo, 20 μL).
Para configurações avançadas, escolha a temperatura de ligação, duração, tipo de ligase e opções de tratamento do vetor.
Clique em “Calcular” para gerar a quantidade recomendada de inserto e a configuração da reação.

Perguntas Frequentes

Qual é a razão molar ideal de vetor para inserto?

Para ligações de extremidades adesivas, uma razão de vetor para inserto de 1:3 ou 1:5 é geralmente recomendada. Para ligações de extremidades cegas, uma razão mais alta (por exemplo, de 1:5 a 1:10) pode melhorar a eficiência.

Por que a desfosforilação do vetor é recomendada?

A desfosforilação (usando CIP, SAP ou Fosfatase Antártica) previne a auto-ligação do vetor, reduzindo colônias de fundo indesejadas.

Quais condições de ligação devo usar?

16°C por 4 horas – Condição padrão para ligase de DNA T4.
Temperatura ambiente por 15 minutos – Adequado para Ligase Rápida.
Durante a noite a 16°C – Recomendado para ligações desafiadoras ou clonagem de extremidades cegas.

Como posso melhorar a eficiência da ligação?

Assegure a razão molar correta para vetor e inserto.
Use ligase de DNA e tampão frescos.
Otimize as condições de ligação (temperatura e duração).
Confirme a presença do inserto via eletroforese em gel antes da ligação.

Por que Usar Este Calculador?

Este Calculador de Ligação simplifica a configuração de reações de ligação de DNA, ajudando pesquisadores a determinar as quantidades certas de vetor e inserto para uma clonagem eficiente. Ao automatizar cálculos e oferecer dicas de otimização, ele economiza tempo e aumenta a taxa de sucesso de experimentos de ligação.